Сюжет развивается в конце XV — начале XVI века, преимущественно в Риме. Периодически события переносятся в наше время, где главным героем является Дезмонд Майлс, обучающийся искусствам ассасина с помощью машины «Анимус 2.0». Главный герой исторической части игры — Эцио Аудиторе да Фиренце, один из лидеров и наставников ордена ассасинов.