Синтез кДНК путем обратной транскрипции

Обычно ДНК транскрибируется в мРНК, но этот процесс может быть и обратим. Для этого мы можем использовать 3'-поли А-хвост, общий для всех мРНК. Поскольку этот хвост содержит только аденозиновые нуклеотиды, мы можем использовать его в качестве места для нашего праймера. Мы можем использовать олиго (dt) праймер, который содержит последовательность из 12-20 тиминовых нуклеотидов, что означает, что он комплементарен 3'-поли А-хвосту мРНК. Теперь обратная транскриптаза может присоединиться к праймированной области и синтезировать комплементарную цепь ДНК в направлении 3'-5'. После того, как обратная транскриптаза закончит, у нас останется 1/2 молекулы мРНК и 1/2 молекулы кДНК. Никинг РНК с помощью РНКазы H решает эту проблему, создавая «дырки» в цепи РНК, что, в свою очередь, обеспечивает сайты праймирования 3'-ОН. ДНК-полимераза 1 может заделывать эти дырки посредством обычного синтеза ДНК в направлении 5’-3’. Но, кроме того, ДНК-полимераза 1 обладает экзонуклеазной активностью, то есть способна удалять и заменять оставшуюся мРНК в молекуле! Наконец, ДНК-лигаза может склеивать молекулы, катализируя образование фосфодиэфирных связей в ДНК. Таким образом, мРНК полностью заменяется кДНК. Но, Лукас, это похоже на кучу дополнительных шагов, только для того, чтобы создать ДНК, я слышу, как ты кричишь в экран. Я задавался тем же вопросом, и причина, по которой это всё ещё так полезно, заключается в том, что эта кДНК и ДНК — не одно и то же. Помните, эта кДНК была создана только из мРНК, которые, в свою очередь, были созданы из ДНК, готовой к экспрессии. Другими словами, эта кДНК не содержит интронов и не содержит всей ДНК, которая не экспрессируется! Так почему же так полезно генерировать кДНК? Оказывается, есть две основные причины: 1. Транскриптомика, где кДНК можно анализировать с помощью ПЦР-анализа для количественного определения экспрессии генов организма. 2. Клонирование генов, где кДНК можно встроить в плазмиду, которую, в свою очередь, можно встроить в организм, который затем экспрессирует выбранный ген.